一、活性氧檢測(cè)

自由基(free radicals)，是指帶不成對(duì)電子的原子、分子、離子或原子團(tuán)。自由基的種類很多，如以氧(O)、碳(C)、氮(N)為中心的活性基團(tuán)?；钚匝踝?reactive oxygen species, ROS)是生物體內(nèi)一些氧化反應(yīng)中形成的氧自由基，常見有超氧化陰離子(O2－)，過(guò)氧化氫(H2O2)，過(guò)氧化自由基(ROO－)和氫氧自由基(OH－)等形式。自由基外層具有非配對(duì)電子，其化學(xué)性質(zhì)非?；顫?，它既是電子供體，又是電子受體。

活性氧是細(xì)胞線粒體氧化呼吸中產(chǎn)生的自由基活性的物質(zhì)，參與細(xì)胞多種生理和病理形成機(jī)制。檢測(cè)細(xì)胞ROS的含量，可以了解ROS在細(xì)胞一些生理和病理狀態(tài)中的變化，分析藥物效應(yīng)和相關(guān)機(jī)制。

活性氧檢測(cè)試劑盒是利用ROS熒光探針－DCFH-DA進(jìn)行活性氧檢測(cè)的試劑盒。DCFH-DA本身沒(méi)有熒光，可自由透過(guò)活細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)后，可以被細(xì)胞內(nèi)的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透細(xì)胞膜，從而使探針很容易被裝載到細(xì)胞內(nèi)。細(xì)胞內(nèi)的活性氧可以氧化無(wú)熒光的DCFH生成有熒光的DCF。檢測(cè)DCF的熒光就可以知道細(xì)胞內(nèi)的活性氧水平。根據(jù)活細(xì)胞中紅色熒光的產(chǎn)生，可以判斷細(xì)胞ROS含量的多少和變化。本試劑盒本底低，靈敏度高，線性范圍寬，使用方便。

二、TUNEL

TUNEL(TdT-mediated DUTP nick end labeling)細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒是用來(lái)檢測(cè)組織細(xì)胞在凋亡早期過(guò)程中細(xì)胞核DNA的斷裂情況。其原理是熒光素（fluorescein）標(biāo)記的dUTP在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT Enzyme）的作用下，可以連接到凋亡細(xì)胞中斷裂DNA的3’-OH末端，并與連接辣根過(guò)氧化物酶（HRP，horse-radish peroxidase）的熒光素抗體特異性結(jié)合，后者又與HRP第五二氨基聯(lián)苯胺（DAB）反應(yīng)產(chǎn)生很強(qiáng)的顏色反應(yīng)（呈深棕色），特異準(zhǔn)確地定位正在凋亡的細(xì)胞，因而在光學(xué)顯微鏡下即可觀察凋亡細(xì)胞。由于正常的或正在增值的細(xì)胞幾乎沒(méi)有DNA斷裂，因而沒(méi)有3’-OH形成，很少能夠被染色。TUNEL細(xì)胞凋亡試劑盒適用于組織樣本（石蠟包埋、冰凍和超薄切片）和細(xì)胞樣本（細(xì)胞涂片）在單細(xì)胞水平上的凋亡原位檢測(cè)。

三、Annexin/PI染色

凋亡和壞死，是常見的細(xì)胞死亡的兩種方式，它們有著截然不同的特征。凋亡是細(xì)胞程序性死亡的主要表現(xiàn)形式，是一個(gè)主動(dòng)性的生理反應(yīng)機(jī)制；壞死則是細(xì)胞對(duì)嚴(yán)重?fù)p傷的一種被動(dòng)反應(yīng)和變性過(guò)程。

凋亡涉及一系列復(fù)雜的生理生化反應(yīng)，終導(dǎo)致細(xì)胞的解體。凋亡細(xì)胞的許多改變是特征性的。

細(xì)胞與胞核固縮是凋亡早期發(fā)生的形態(tài)學(xué)變化，這些改變與細(xì)胞骨架的特異性解體有關(guān)。核固縮伴隨的染色體固縮，有顯著的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)。碎裂的核片斷可以被胞膜包裹游離出細(xì)胞外，成為凋亡小體，并被周圍細(xì)胞吞噬。染色質(zhì)的這些特征性變化，可以用顯微鏡直接觀察，或用一些熒光染料染色，在熒光顯微鏡下觀察或進(jìn)行流式細(xì)胞分析。

Annexin是一類廣泛分布于真核細(xì)胞細(xì)胞漿內(nèi)鈣離子依賴的磷酯結(jié)合蛋白，參與細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。但僅Annexin V被報(bào)道可以調(diào)控一些PKC的活性。

Annexin V選擇性結(jié)合磷酯酰絲氨酸(phosphatidylserine，簡(jiǎn)稱PS)。磷酯酰絲氨酸主要分布在細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)，即與細(xì)胞漿相鄰的一側(cè)。在細(xì)胞發(fā)生凋亡的早期，不同類型的細(xì)胞都會(huì)把磷酯酰絲氨酸外翻到細(xì)胞表面，即細(xì)胞膜外側(cè)。磷酯酰絲氨酸暴露到細(xì)胞表面后會(huì)促進(jìn)凝血和炎癥反應(yīng)。而Annexin V和外翻到細(xì)胞表面的磷酯酰絲氨酸結(jié)合后可以阻斷磷酯酰絲氨酸的促凝血和促炎癥反應(yīng)活性。用帶有綠色熒光的熒光探針FITC標(biāo)記的Annexin V，即Annexin V-FITC，就可以用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡非常簡(jiǎn)單而直接地檢測(cè)到磷酯酰絲氨酸的外翻這一細(xì)胞凋亡的重要特征。因此Annexin V是檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡的靈敏指標(biāo)。

碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)染色液是一種核酸染料，它不能透過(guò)完整的細(xì)胞膜，但可以染色壞死細(xì)胞或凋亡晚期喪失細(xì)胞膜完整性的細(xì)胞，呈現(xiàn)紅色熒光。對(duì)于壞死細(xì)胞，由于細(xì)胞膜的完整性已經(jīng)喪失，Annexin V-FITC可以進(jìn)入到細(xì)胞漿內(nèi)，與位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)的磷酯酰絲氨酸結(jié)合，從而也使壞死細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光。因此將Annexin-V與PI匹配使用，就可以將凋亡早晚期的細(xì)胞以及壞死細(xì)胞區(qū)分開來(lái)。