進行分子實驗檢測時需要先準備PCR反應混合物:根據DNA樣本的數(shù)量來確定除了DNA外其他混合物的體積(額外增加一份來確保有足夠的PCR反應混合物),將擴增每一個遺傳標記并且在每一個PCR反應管內分19.5uL的反應混合物。
配制膠溶液:將25g尿素、7.5mL40%丙烯酰胺:PDA(19:1)加入到250mL的錐形瓶中。加蒸餾水至50mL,充分混勻來溶解尿素(見注釋4)。
準備制膠板:把膠板洗干凈,確保上面沒有灰塵,用硅化玻璃板。根據各個廠家的不同把玻璃板夾在一起并且用膠條封住底部(這一過程根據設備的不同而有所變化)。
如果不用帶有加熱蓋的PCR儀,那么就需要在每個管子的頂部加入礦物油來防止液體蒸發(fā)。
進行分子實驗檢測時在每個管子中加0.5的DNA樣本。
把管子放在PCR儀中,95℃加熱3min變性DNA。
95℃變性40s、55℃引物退火40s、72℃延伸40s,循環(huán)30-35次。
把PCR產物和尿素上樣緩沖液1:1混合.
加入500uL10%的過硫酸銨到膠混合液中并且通過濾紙過濾。
取出10mL膠溶液加入到一個小燒杯中并且加10~15。馬上將膠倒到板上。幾分鐘之內膠將聚合到一起,封玻璃板的底部。
封好膠后,加15ul到剩余的膠溶液中并且馬上把膠倒到兩塊膠板之間。仔細插入膠梳子,讓膠聚合2h至過夜。
取下膠底部的封條。把膠放在電泳槽中確保電極插入的方向正確。將膠槽中灌滿(大約1.5L,根據裝置的不同量有所不同)。拔掉膠梳子,沖洗上樣孔。
把膠預熱60min直到溫度在50℃左右。
在上樣之前再次用加樣器沖洗上樣孔。在每個孔中加產物和上樣染料(上樣量根據梳子的大小和PCR產物的濃度而不同)。根據產物片段大小的不同跑膠時間可以從30min到3h之間變化。